Unser Gehirn enthält Millionen von Synapsen—die verbindungen, die die übertragung von Nachrichten von neuron zu neuron. Innerhalb dieser Synapsen sind Hunderte von verschiedenen Proteinen und Dysfunktion dieser Proteine kann zu Bedingungen führen, wie Schizophrenie und Autismus.
Forscher am MIT und der Broad Institute der Harvard und MIT haben sich jetzt ausgedacht, einen neuen Weg, um schnell Bild-diese synaptischen Proteine mit hoher Auflösung. Mit fluoreszierenden Nukleinsäure-Sonden, können Sie Etikett und Bild eine unbegrenzte Anzahl von verschiedenen Proteinen. Sie demonstrierten die Technik in einer neuen Studie, in der Sie abgebildet 12 Proteine im zellulären Proben mit tausenden von Synapsen.
“Multiplex-imaging ist wichtig, denn es gibt so viel Variabilität zwischen den Synapsen und Zellen, auch innerhalb der gleichen Gehirn”, sagt Mark Baden, ein MIT-außerordentlicher professor der biologischen Technik. “Sie müssen wirklich Blick gleichzeitig an Proteinen in der Probe zu verstehen, was Subpopulationen von verschiedenen Synapsen Aussehen, entdecken Sie neue Arten von Synapsen und zu verstehen, wie genetische Variationen Sie auswirken.”
Die Forscher planen, diese Technik zu verwenden, weiter zu studieren, was passiert mit den Synapsen, wenn Sie blockieren, die expression von Genen, die im Zusammenhang mit bestimmten Krankheiten, in der Hoffnung des Entwickelns von neuen Behandlungen, könnte umgekehrter diese Effekte.
Baden und Jeff Cottrell, Direktor der translationalen Forschung an der Stanley-Mitte für Psychiatrische Forschung am Broad Institute, sind die senior-Autoren der Studie, die heute in “Nature Communications”. Lead-Autoren des Papiers sind ehemalige postdocs Syuan-Ming Guo und Remi Veneziano, ehemalige Doktorand Simon Gordonov, und ehemaliger wissenschaftlicher Mitarbeiter Li Li.
Bildgebung mit DNA
Synaptische Proteine haben eine Vielzahl von Funktionen. Viele von Ihnen helfen zu bilden synaptische Gerüste, sind beteiligt an der Sekretion von Neurotransmittern und die Bearbeitung der eingehenden Signale. Während Synapsen enthalten Hunderte dieser Proteine, die konventionelle Fluoreszenz-Mikroskopie beschränkt sich auf imaging höchstens vier Proteinen zu einer Zeit.
Zu steigern, die Anzahl, das MIT-team eine neue Technik entwickelt, basierend auf einer vorhandenen Methode aufgerufen, DNA-PAINT. Mit dieser Methode, ursprünglich entwickelt von Ralf Jungmann, der Max-Planck-Institut für Biochemie, Forscher label Proteine oder andere Moleküle von Interesse mit einem DNA-Antikörper-Sonde. Dann, Sie Bild jedes protein durch die Bereitstellung einer fluoreszierenden DNA – “oligo”, die bindet an die DNA-Antikörper-Sonden.
Die DNA-Stränge haben eine von Natur aus geringe Affinität für einander, so dass Sie binden und lösen in regelmäßigen Abständen, erstellen eine blinkende Fluoreszenz, dargestellt werden können mit super-resolution-Mikroskopie. Allerdings imaging jedes protein dauert etwa eine halbe Stunde, so dass es unpraktisch für imaging-viele Proteine in einer großen Stichprobe.
Baden und seine Kollegen erstellen Sie eine schnellere Methode, die erlauben würde, Sie zu analysieren, eine große Anzahl von Proben in einem kurzen Zeitraum von Zeit. Um das zu erreichen, veränderten Sie die DNA-dye imaging-Sonde, so dass es binden würde stärker auf die DNA-Antikörper, so genannte ” locked-Nukleinsäuren. Dies gibt ein viel helleres signal, so dass die Bildgebung kann durchgeführt werden schneller, aber bei etwas niedriger Auflösung.
“Wenn wir 12 oder 15 Farben auf einem einzigen gut von Neuronen, das ganze experiment dauert eine Stunde, im Vergleich mit übernachtung für die super-Auflösung entspricht,” Baden, sagt.
Die Forscher verwendeten diese Technik, um label 12 verschiedene Proteine in der synapse, einschließlich Gerüst-Proteine, die im Zusammenhang mit dem zytoskelett, und Proteine, die bekannt sind, zu markieren, erregenden oder hemmenden Synapsen. Eines der Proteine, die Sie angeschaut wird, shank3, ein gerüstprotein, das mit sowohl Autismus und Schizophrenie.
Durch die Analyse der protein-Ebene in tausenden von Nervenzellen, die Forscher waren in der Lage, um zu bestimmen, Gruppen von Proteinen, die dazu neigen, zu assoziieren, mit einander sich öfter als die anderen, und zu lernen, wie die unterschiedlichen Synapsen unterschiedliche Proteine, die Sie enthalten. Diese Art von Informationen könnten verwendet werden, um zu helfen, zu klassifizieren Synapsen in Subtypen, die helfen könnten, zu offenbaren Ihre Funktionen.
“Hemmende und erregende sind die kanonischen synapse-Typen, aber es wird spekuliert, dass es zahlreiche verschiedene Subtypen von Synapsen, ohne wirklichen Konsens, was diese sind,” Baden, sagt.
Das Verständnis von Krankheit
Die Forscher zeigten auch, dass Sie Messen Veränderungen in der synaptischen protein-Ebene, die auftreten, nachdem Neuronen behandelt werden mit einer Verbindung namens tetrodotoxin (TTX), das stärkt die synaptischen verbindungen.
“Mit konventionellen immunfluoreszenz, können Sie in der Regel extrahieren von Informationen aus drei oder vier Ziele, die innerhalb der gleichen Probe, aber mit unserer Technik, waren wir in der Lage, erweitern die Anzahl auf 12 verschiedene Ziele innerhalb der gleichen Probe. Wir wandten diese Methode zu prüfen synaptischen Umbau, der Auftritt, nach der Behandlung mit TTX, und unser Befund bestätigt frühere arbeiten, die ergab, eine koordinierte hochregulation synaptischer Proteine folgenden TTX-Behandlung”, sagt Eric Danielson, eine MIT senior-postdoc-wer ist eine Autorin der Studie.
Die Forscher sind jetzt mit dieser Technik, genannt PRISM, zu untersuchen, wie die Struktur und Zusammensetzung der Synapsen betroffen sind, durch Ausschlagen Gene, die mit verschiedenen Störungen. Sequenzierung der Genome von Menschen mit Störungen wie Autismus und Schizophrenie offenbart hat Hunderte von Krankheit-verbundene genetische Varianten, und für die meisten von den Varianten, die Wissenschaftler haben keine Ahnung, wie Sie beitragen zur Krankheit.
